激光掃描共聚焦顯維鏡定量分析的優勢和注意事項

激光掃描共聚焦顯微鏡與圖像半定量分析相比，具有以下優點：
 
    1．更精細、度更高。激光掃描共聚焦顯微鏡對免疫熒光組織化學染色樣品做定量分析時，利用激光聚焦和系統軟件分析對組織進行深層掃描，不破壞組織細胞結構，可深層次準確定位并定量。而一般圖像分析只是以熒光灰度的差別變化進行半定量分析。
 
    2．激光掃描共聚焦顯微鏡一般有兩個以上不同波長的激光管，只要將標本標記上不同波長的熒光，就可以在同一張切片上同時分析兩種或更多不同指標的變化，并比較它們之間的比值變化，而又方便，這一特點是一般圖像分析*的。
 
    3．激光掃描共聚焦顯微鏡可根據需要提供純熒光、白光以及熒光與白光合成圖像等多種圖像，遠遠優于一般圖像分析。
 
    4．以往免疫熒光染色多要求冰凍新鮮組織標本，用石蠟切片在普通熒光顯微鏡下觀察，常因背景非特異性熒光過強影響觀察結果。而石蠟標本來源廣泛，適用于回顧性研究。激光掃描共聚焦顯微鏡可掃描石蠟切片的熒光染色，可避免因背景非特異性熒光過強而影響觀察結果，從而可獲得清晰圖像，這也是激光掃描共聚焦顯微鏡的優勢所在。
 
激光掃描共聚焦顯維鏡定量分析的注意事項
 
《一》制備高特異性和價的熒光抗體
 
    標本只有在用熒光探針標記的前提下才能進行共聚焦顯微鏡檢測．制備高特異性和價的熒光抗體是檢測的關鍵。這就要求選用高質量的熒光素和高特異性與價的免疫血清。同時還要對熒光抗體進行質量鑒定，主要是進行特異性和敏感性鑒定。
 
《二》標本制作要求
 
    1．標本厚度  組織切片或其他標本不能太厚，否則激發光多數消耗在標本下部，而物鏡觀察的上部不能被充分激發。
 
    2．載玻片  載玻片要光潔，無自發熒光；載玻片厚度應在0．8～1．2mm之間，太厚會吸收較多的光，不能使激發光在標本上聚焦。
 
    3．封固劑  甘油必須無色透明，無自發熒光。由于熒光在pH 8．5～9．5時較亮，不易很快退去，常用甘油加入0．5mol／lpH 9．0～9．5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液封片。
 
《三》定量研究的要求
 
    1．隨機性
    （1）在感興趣區域內隨機抽樣，不能主觀地選擇一些便于定量的“理想切片”，這種“理想切片”不能代表所要研究的整體區域。
    （2）在隨機抽取的切片上，應隨機抽取觀察視野。
    （3）在隨機抽取的視野中，通過連續觀察“光學切片”，得到感興趣結構的三維定量信息。如果不能連續觀察“光學切片”，需要在Z軸方向隨機抽樣，然后作定量研究。
 
    2．避免參照陷阱  如果獲得的資料是密度信息，當比較各組參照空間（包含待測結構的區域）的體積不同時，根據密度信息可能得出錯誤結論。因此，需要注意所謂的參照空間“陷阱”問題。