激光掃描共聚焦顯維鏡定量分析的優(yōu)勢(shì)和注意事項(xiàng)

激光掃描共聚焦顯微鏡與圖像半定量分析相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
 
    1．更精細(xì)、度更高。激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)免疫熒光組織化學(xué)染色樣品做定量分析時(shí)，利用激光聚焦和系統(tǒng)軟件分析對(duì)組織進(jìn)行深層掃描，不破壞組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可深層次準(zhǔn)確定位并定量。而一般圖像分析只是以熒光灰度的差別變化進(jìn)行半定量分析。
 
    2．激光掃描共聚焦顯微鏡一般有兩個(gè)以上不同波長(zhǎng)的激光管，只要將標(biāo)本標(biāo)記上不同波長(zhǎng)的熒光，就可以在同一張切片上同時(shí)分析兩種或更多不同指標(biāo)的變化，并比較它們之間的比值變化，而又方便，這一特點(diǎn)是一般圖像分析*的。
 
    3．激光掃描共聚焦顯微鏡可根據(jù)需要提供純熒光、白光以及熒光與白光合成圖像等多種圖像，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于一般圖像分析。
 
    4．以往免疫熒光染色多要求冰凍新鮮組織標(biāo)本，用石蠟切片在普通熒光顯微鏡下觀察，常因背景非特異性熒光過強(qiáng)影響觀察結(jié)果。而石蠟標(biāo)本來源廣泛，適用于回顧性研究。激光掃描共聚焦顯微鏡可掃描石蠟切片的熒光染色，可避免因背景非特異性熒光過強(qiáng)而影響觀察結(jié)果，從而可獲得清晰圖像，這也是激光掃描共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢(shì)所在。
 
激光掃描共聚焦顯維鏡定量分析的注意事項(xiàng)
 
《一》制備高特異性和價(jià)的熒光抗體
 
    標(biāo)本只有在用熒光探針標(biāo)記的前提下才能進(jìn)行共聚焦顯微鏡檢測(cè)．制備高特異性和價(jià)的熒光抗體是檢測(cè)的關(guān)鍵。這就要求選用高質(zhì)量的熒光素和高特異性與價(jià)的免疫血清。同時(shí)還要對(duì)熒光抗體進(jìn)行質(zhì)量鑒定，主要是進(jìn)行特異性和敏感性鑒定。
 
《二》標(biāo)本制作要求
 
    1．標(biāo)本厚度  組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，否則激發(fā)光多數(shù)消耗在標(biāo)本下部，而物鏡觀察的上部不能被充分激發(fā)。
 
    2．載玻片  載玻片要光潔，無自發(fā)熒光；載玻片厚度應(yīng)在0．8～1．2mm之間，太厚會(huì)吸收較多的光，不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚焦。
 
    3．封固劑  甘油必須無色透明，無自發(fā)熒光。由于熒光在pH 8．5～9．5時(shí)較亮，不易很快退去，常用甘油加入0．5mol／lpH 9．0～9．5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液封片。
 
《三》定量研究的要求
 
    1．隨機(jī)性
    （1）在感興趣區(qū)域內(nèi)隨機(jī)抽樣，不能主觀地選擇一些便于定量的“理想切片”，這種“理想切片”不能代表所要研究的整體區(qū)域。
    （2）在隨機(jī)抽取的切片上，應(yīng)隨機(jī)抽取觀察視野。
    （3）在隨機(jī)抽取的視野中，通過連續(xù)觀察“光學(xué)切片”，得到感興趣結(jié)構(gòu)的三維定量信息。如果不能連續(xù)觀察“光學(xué)切片”，需要在Z軸方向隨機(jī)抽樣，然后作定量研究。
 
    2．避免參照陷阱  如果獲得的資料是密度信息，當(dāng)比較各組參照空間（包含待測(cè)結(jié)構(gòu)的區(qū)域）的體積不同時(shí)，根據(jù)密度信息可能得出錯(cuò)誤結(jié)論。因此，需要注意所謂的參照空間“陷阱”問題。